2024年4月11日，首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院神經(jīng)外科陳贊教授團隊在《British Journal of Cancer》（JCR分區(qū)Q1，IF：8.8）期刊上發(fā)表了題“Single-cell sequencing reveals VEGFR as a potential target for CAR-T cell therapy in chordoma ”的研究論文。宣武醫(yī)院神經(jīng)外科吳煥童博士、張博彥博士為共同第一作者，陳贊教授、段婉茹教授為通訊作者。

脊索瘤是一種罕見的原發(fā)性骨腫瘤，起源于脊索殘余組織。脊索瘤每年的發(fā)病率約為十萬分之0.08，男性居多，發(fā)病高峰期在五十歲左右。目前脊索瘤尚無有效的治療方法，完全手術(shù)切除是現(xiàn)在的主要治療手段。因為手術(shù)復(fù)雜（如鄰近神經(jīng)或血管）導(dǎo)致切除不完全的患者會在術(shù)后進行放療。脊索瘤患者的中位總生存期（OS）約為6到7年，但臨床病程各不相同。脊索瘤一般表現(xiàn)為為中低分化、局部侵襲性惡性腫瘤，但其表現(xiàn)可能多種多樣，導(dǎo)致有些患者病情進展迅速。因此，約有三分之一的脊索瘤患者會出現(xiàn)局部擴散和轉(zhuǎn)移，在復(fù)發(fā)、難治或轉(zhuǎn)移的情況下，脊索瘤被治愈可能性較低。

因此，亟需有效的療法來減少復(fù)發(fā)和病情進展，并在復(fù)發(fā)時進行治療。

陳贊教授團隊通過收集臨床患者的腫瘤樣本組織進行單細胞測序，通過分析脊索瘤患者的腫瘤異質(zhì)性和基因表達情況來尋找脊索瘤治療的潛在靶點。2022年，陳贊教授團隊發(fā)表首篇脊索瘤患者的單細胞測序文章“Single‐cell transcriptome profiling reveals intra‐tumoral heterogeneity in human chordomas ”發(fā)表在《Cancer Immunol Immunotherapy》（JCR分區(qū)Q1，IF：5.8）。

近日，研究團隊在前期研究的基礎(chǔ)上，擴大脊索瘤測序樣本量，對脊索瘤的靶點、信號通路的相關(guān)表達進行檢測。發(fā)現(xiàn)可用于脊索瘤免疫治療的靶點VEGFR，構(gòu)建VEGFR CAR-T細胞。同時發(fā)現(xiàn)在脊索瘤細胞的樣本組織中TGF-β信號通路是脊索瘤腫瘤微環(huán)境中高表達的細胞間信號通路。因此在VEGFR CAR結(jié)構(gòu)上增加一個TGF-β scFv結(jié)構(gòu)，能夠結(jié)合腫瘤微環(huán)境中的TGF-β，改善TGF-β對脊索瘤細胞的影響。

對14例脊索瘤患者的腫瘤組織樣本進行單細胞測序。檢測發(fā)現(xiàn)脊索瘤腫瘤樣本中異質(zhì)性高，腫瘤組織中細胞成分復(fù)雜。在腫瘤細胞方面，原發(fā)腫瘤樣本和復(fù)發(fā)腫瘤樣本存在差異。在腫瘤微環(huán)境中，發(fā)現(xiàn)免疫細胞（主要是T細胞和B細胞）中TGF-β的表達增加，以及內(nèi)皮細胞和腫瘤細胞中VEGFR2的表達增加，這在原發(fā)樣本和復(fù)發(fā)樣本中都是一致的。脊索瘤腫瘤樣本的免疫組化進一步證實了這些表達模式（圖1）。

接下來，我們進行了細胞間通訊分析，以確定脊索瘤腫瘤微環(huán)境內(nèi)潛在的相互作用途徑。Cellchat分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了TME內(nèi)的TGF-β信號傳導(dǎo)是高表達的。這一通路的主要特點是T細胞和B細胞以及內(nèi)皮細胞是TGF-β信號的主要發(fā)送者，而髓系細胞和成纖維細胞則是接收者。在這一途徑中，最顯著的配體-受體相互作用是TGFβ1-TGFβR1/TGFβR2（圖2）。

圖1. 人類脊索瘤的單細胞異質(zhì)性圖譜

圖2. 脊索瘤腫瘤微環(huán)境的細胞通訊網(wǎng)絡(luò)分析

通過測序確定了脊索瘤中TGFβ和VEGFR高表達后，課題組制備了兩種靶向血管內(nèi)皮生長因子受體的CAR：VEGFR CAR和與TGF-β scFv 結(jié)合的VEGFR/TGF-β scFv CAR。接下來，用具有惡性增殖潛能的JHC-7脊索瘤細胞系評估了CAR-T細胞對表達VEGFR的脊索瘤細胞的激活和殺傷作用。對照組、VEGFR和VEGFR/TGF-β scFv CAR-T 細胞與JHC-7細胞以不同的效應(yīng)物-靶標比孵育。VEGFR CAR-T細胞和VEGFR/TGF-β scFv CAR-T細胞對JHC-7細胞都表現(xiàn)出細胞毒性，這種毒性與E/T比呈正相關(guān)。

為了評估CAR-T細胞變體對腫瘤細胞的持續(xù)影響，在第0、2、4和6天將 JHC-7 腫瘤細胞引入培養(yǎng)系統(tǒng)。在不同的時間間隔內(nèi)，觀察的VEGFR和VEGFR/TGF-β scFv CAR-T細胞對腫瘤細胞的持續(xù)殺傷作用。

TGF-β在實體瘤的免疫抑制中起著至關(guān)重要的作用。因此，我們將VEGFR CAR-T細胞和VEGFR/TGF-βCAR-T細胞與JHC-7細胞以4:1的E:T比例共培養(yǎng)20小時，并在培養(yǎng)體系中加入外源的TGF-β因子。與VEGFRCAR-T實驗組相比，VEGFR/TGF-β scFv CAR-T細胞表現(xiàn)出更強的細胞毒性。與TGF-β共培養(yǎng)時，兩種CAR-T細胞的細胞毒性都有所下降。然而，VEGFR/TGF-β scFv CAR-T的減少了培養(yǎng)體系內(nèi)的TGF-β，從而提高了殺傷效果。VEGFR/TGF-β scFv CAR-T細胞顯示出更好的持續(xù)殺傷能力（圖3）。

圖3.VEGFR CAR 和VEGFR/TGF-β CAR-T細胞的制備和組成

為了評估CAR-T細胞在臨床環(huán)境中的有效性，我們在表達VEGFR的患者源性脊索瘤類器官模型中對其殺傷效果進行了測試。對照組、VEGFR和VEGFR/TGF-β scFv CAR-T細胞以不同的E/T比孵育。VEGFR CAR-T細胞和VEGFR/TGF-β scFv CAR-T細胞對類器官表現(xiàn)出明顯的細胞毒性，細胞毒性與E/T比值呈正相關(guān)。VEGFR/TGF-β scFv CAR-T細胞的細胞毒性優(yōu)于VEGFR CAR-T細胞。

為了評估CAR-T細胞對原代脊索瘤細胞的持續(xù)細胞毒性，課題組將CAR-T細胞與原代脊索瘤細胞共培養(yǎng)，每隔一天時間重復(fù)加入原代腫瘤細胞，以評估CAR-T細胞的持續(xù)細胞毒性。研究發(fā)現(xiàn)VEGFR/TGF-β scFv CAR-T細胞對脊索瘤類器官表現(xiàn)出更持久的持續(xù)細胞毒性。同時檢測共培養(yǎng)體系中細胞上清中TGF-β的濃度，VEGFR/TGF-β scFv CAR-T細胞在培養(yǎng)系統(tǒng)中表現(xiàn)出對TGF-β的親和力增強，從而保留了CAR-T細胞的細胞毒性（圖4）。

圖4.VEGFR/TGF-β在患者源性脊索瘤類器官模型中殺傷效果

課題組分析了14例脊索瘤患者的單細胞測序數(shù)據(jù)，從而為脊索瘤生物學(xué)以及脊索瘤中惡性細胞、間質(zhì)細胞和免疫細胞圖譜提供了重要結(jié)果。測序結(jié)果顯示，VEGFR是CAR-T治療脊索瘤的一個潛在靶點，并且TGF-β可以聯(lián)合用于脊索瘤免疫治療。實驗表明，VEGFR/TGF-β scFv CAR-T細胞對脊索瘤細胞(包括原發(fā)性脊索瘤類器官)表現(xiàn)出較強的細胞毒性和對腫瘤細胞的持續(xù)殺傷能力。雖然CAR-T細胞在脊索瘤患者異種移植模型或其他有效的體內(nèi)模型中需要進一步的臨床前驗證，但這項研究為脊索瘤患者提供了新的治療選擇。

論文鏈接：

https://doi.org/10.1038/s41416-024-02635-5

通訊作者

陳贊，神經(jīng)外科主任醫(yī)師，教授，博士研究生導(dǎo)師。

畢業(yè)于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)，在閆景龍教授指導(dǎo)下獲得醫(yī)學(xué)碩士、在楊立莊教授指導(dǎo)下獲得神經(jīng)外科博士學(xué)位，并在宣武醫(yī)院凌鋒教授指導(dǎo)下進一步攻讀博士后，研究方向：顯微脊柱外科。學(xué)術(shù)職務(wù)：中華醫(yī)學(xué)會神經(jīng)外科分會脊柱神經(jīng)外科學(xué)組副組長、中華醫(yī)師協(xié)會神經(jīng)外科分會委員會脊柱神經(jīng)外科學(xué)組專家委員、中國醫(yī)療保健國際交流促進會骨科疾病防治專業(yè)委員會脊柱內(nèi)鏡組副主委、北京康復(fù)醫(yī)學(xué)會脊柱脊髓損傷第五屆專業(yè)委員會副主委、AO國際脊柱外科學(xué)會講師、世界神經(jīng)外科聯(lián)合會(WFNS)脊柱學(xué)組委員、國際顱頸交界區(qū)畸形和脊柱學(xué)會執(zhí)行委員。

擅長應(yīng)用顯微神經(jīng)外科技術(shù)等微侵襲方式治療頸椎病、腰椎間盤突出癥、腰椎管狹窄、椎管內(nèi)腫瘤、Chiari畸形、脊髓空洞癥、寰樞椎脫位方面具有豐富臨床經(jīng)驗。

每年手術(shù)例數(shù)超過1000例，累計手術(shù)量超萬例。主持科研課題10余項，參編著作多部，發(fā)表SCI論文10篇，核心期刊論文30篇，獲得國家專利2項。

【出診時間】周三上午、周三下午

通訊作者

段婉茹，宣武醫(yī)院神經(jīng)外科副主任醫(yī)師，副教授，碩士生導(dǎo)師。

從事脊柱脊髓微創(chuàng)手術(shù)治療；主持中國國際神經(jīng)科學(xué)研究所脊髓損傷與功能重建實驗室工作，任中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院脊柱畸形大數(shù)據(jù)研究應(yīng)用重點實驗室PI；并長期負責(zé)神經(jīng)脊柱中心的教學(xué)和培訓(xùn)。以第一作者和通訊作者發(fā)表中英文論文三十余篇。主持科技部重點研發(fā)（青年科學(xué)家項目）、國自然，北自然-海淀、科委首特項目等項目及課題。入選北京醫(yī)管局青苗人才。

兼任中國女醫(yī)師協(xié)會神經(jīng)外科專委會常委兼秘書長，中國殘疾人康復(fù)協(xié)會第一屆人工智能康復(fù)專業(yè)委員會副主任委員，中國解剖學(xué)會人腦庫研究分會委員；北京衛(wèi)生法學(xué)大數(shù)據(jù)與互聯(lián)網(wǎng)人工智能醫(yī)療專業(yè)委員會委員，《中華創(chuàng)傷雜志》青年學(xué)術(shù)委員會委員；AO Spine青年講師，Human Brain雜志編委；中國志愿醫(yī)生組織成員，太陽語罕見病心理關(guān)懷中心醫(yī)療康復(fù)顧問，房山區(qū)青聯(lián)第五屆委員會常委。 

獲第二屆中國健康長壽創(chuàng)新大賽三等獎、第五屆中國醫(yī)療器械創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)大賽醫(yī)院專場賽二等獎、北京醫(yī)學(xué)會神經(jīng)外科學(xué)術(shù)年會青年醫(yī)師手術(shù)展示優(yōu)秀獎；中國初級衛(wèi)生保健基金會-大病不出縣行走的醫(yī)院醫(yī)者工匠獎、第六屆國之名醫(yī)青年新銳。

【出診時間】周二上午

第一作者

吳煥童，博士畢業(yè)于首都醫(yī)科大學(xué)，現(xiàn)為首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院神經(jīng)外科博士后。從事脊索瘤免疫治療的基礎(chǔ)研究。主要研究方向為CAR-T細胞治療惡性腫瘤，參與過CAR-T細胞治療B細胞急性淋巴瘤臨床試驗，發(fā)表SCI論文4篇。

共同第一作者

張博彥，首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院在讀博士研究生，師從陳贊教授。主要研究方向為脊柱脊髓疾病。以第一或共同第一作者發(fā)表SCI文章2篇。